Krev je složena z buněčné (korpuskulární) složky a krevní plasmy. Krevní plasma je využívána hlavně jako transportní médium. Obsahuje kromě živin a metabolických zplodin také řadu látek určených ke zvlášťním účelům (imunitní reaktanty, hormonální působky, transportní mediátory atd.). Většina těchto látek je bílkovinné povahy, můžeme je jednoduše rozdělit na albumin, globuliny, fibrinogen a četné bílkoviny s různou biologickou aktivitou (hormony, enzymy, složky srážecího a komplementového systému) vyskytujících se za normálních okolností ve velmi malé koncentraci.

Alfa a beta globuliny jsou ještě děleny do dvou subfrakcí: alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2. Jednotlivé imunoglobuliny lze pak kvantifikovat přidáním polyklonálního antiséra tzv. imunoelektroforesou.

Koncentrace albuminu stanovené elektroforesou krevních bílkovin obvykle nedosahuje hodnot získaných chemickými metodami. Tento rozdíl je dán artefakty při hodnocení intenzity zbarvení elektroforetických pruhů, kdy intenzivně zbarvené části (albumin) jsou podhodnoceny a části méně zbarvené jsou naopak nadhodnoceny, proto poměr albumin : globulin (A/G) získaný spektrofotometrickými metodami je vyšší než poměr získaný elektroforesou. Proto je nutné hladinu albuminu posuzovat chemickými metodami souběžně z ELFO. V současnosti snadno dostupné stanovení albuminu z krevního séra i v ordinaci pomocí refraktometru má svá úskalí v často falešně zvýšených koncentrací při hyperlipémii, hyperbilirubinémii, azotémii, hypernatrémii a hyperchlorémii. Falešně zvýšená koncentrace celkové bílkoviny se při hyperbilirubinémii vyskytuje též u spektrofotometrických metod.

Albumin

Albumin tvoří kolem 55-60 % všech plasmatických bílkovin. Hlavní funkcí je udržování koloidně osmotického tlaku a transport různých nízkomolekulárních látek. Plasmatická koncentrace je relativně stálá a je výsledkem tří fyziologických procesů: syntézy a sekrece; distribuce; degradace.

Albumin představuje hlavní sekretorní protein jater (množstevně asi 25 % veškerých syntetizovaných proteinů v játrech). Průměrná lidská játra vyprodukují na každý kilogram hmotnosti 200 mg albuminu denně. Tvorba albuminu kolísá dle fyziologických potřeb organismu. Hlavními faktory ovlivňujícími syntézu jsou změny onkotického tlaku na povrchu hepatocytů a odpovídající příjem kvalitních bílkovin nebo aminokyselin. Syntéza probíhá hlavně v období adekvátní výživy, dietní deficit větvených řetězců aminokyselin redukuje produkci albuminu. Při nedostatečném přísunu proteinů klesá hladina enzymů v močovinovém cyklu, kde aminokyseliny jako arginin a ornitin svou přeměnou na polyaminy (putrescin, spermitidin a spermin) stimulují syntézu albuminu. Role polyaminů ještě není spolehlivě vysvětlena, i když je známa role aminů v metabolismu DNA a RNA, bunečné regeneraci a synteze bílkovin. Proto dieta musí být vždy vyvážena jak po stránce kalorické tak po stránce strukturální (dostatek kvalitních bílkovin), a to zvláště u jaterních a ledvinných chorob. Celá škála hormonů má vliv na proteosyntézu. Glukokortikoidy, STH, inzulin, testosteron podporují proteosyntézu, kortikoidy a inzulin navíc inhibují proteolýzu. Naopak glukagon a hormony štítné žlázy proteolýzu zvyšují.

Albumin je odváděn z jater žilní krví do krevního oběhu. Z krevních kapilár proniká do intersticia tkání (50-70 % tělesného albuminu je lokalizováno extravaskulárně, hlavně v intersticiu svalů a pojivových tkání), odkud je lymfatickým systémem sbírán opět do krevního řečiště. Při ascitickém onemocnění se nově syntetizovaný albumin distribuuje přímo do efúse. Výměna albuminu mezi krevní plasmou a efúzní tekutinou probíhá mimořádně pomalu. Většina ascitického albuminu pochází přímo z jater tj. nově nasyntetizovaný.

Míra albuminového katabolismu je velmi variabilní (u zdravých lidí dosahuje 2-57 % denního plasmatického poolu). Jestliž vroste velikost tělesného poolu, vzroste i stupeň degradace. Poloviční životnost plasmatického albuminu u psů se uvádí v rozmezí 6,7-9,4 dne (u lidí dosahuje poloviční životnost 14-21 dní).

Plasmatická koncentrace albuminu ovlivňuje přímo velikost katabolismu , což je pravděpodobně způsobeno vyšším průtokem albuminu přes katabolická místa (předpokládá se, že se jedná o vaskulární endotelium). Proto také většina pacientů jeví pouze krátkodobé zlepšení po infúzi albuminu, jelikož se následně velmi zvýší jeho degradace. Transfúze albuminu by proto měla být ponechána jen pro kritické stavy, kdy potřebujeme udržet koloidně osmotický tlak. Na zvýšeném katabolismu se též podílejí biochemické změny související s chronickými patologickými procesy (zde je pokles albuminového poolu též dán velkou produkcí cytokinů, jež inhibují syntesu).

I když má molekula albuminu relativně malou molekulu je nejdůležitější složkou v udržování koloidněosmotického tlaku. Těžká hypoalbuminémie vede k formaci intersticiálního edému a efúzí v tělních dutinách (albumin <15 g/l). Vznik ascitu při těžkých hypoalbuminémíích je často spojen s portální hypertenzí při těžkých hepatopatiích či pravostranném srdečním selhání.

Z klinického hlediska u hypoalbuminémie je velmi důležité omezení vazby některých látek na albumin, což je nutné zvážit hlavně při aplikaci léčiv s velkou vazbou na albumin. V nevázané formě mohou totiž difundovat a vázat se na receptory v tkáních normálně pro ně nedostupných (např. CNS). Při těžkém poklesu albuminů (<15 g/l) se zaměříme hlavně na vyloučení jaterní insuficience, glomerulopatie a exudativní enteropatie, ostatní příčiny většinou nezpůsobí tak velké snížení hladiny albuminů.

Při poklesu albuminu a rovněž hladiny globulinu přichází v úvahu krvácivé stavy, těžké exudativní kožní lese, exudativní enteropatie, případně intenzivní infúzní terapie. Avšak nesmíme zapomenout na existenci exudativních enteropatií se zvýšenou hladinou globulinů (lymfoplasmocytární enteritis u basenji a jiných plemen a další příčiny enteropatií s hyperglobulinémií). Hypoalbuminemie s normální nebo zvýšenou hladinou globulinů se projevuje při snížené produkci albuminů či jejich zvýšené ztrátě. Snížená produkce s mírným až středním poklesem hladiny albuminu je typická pro počínající jaterní insuficience, sníženém příjmu kvalitních proteinů (hladovění, maldigesce, malabsorbce), u hyperglobulinémie tj. upřednostnění syntézy globulinů či jako reakce na zvýšenou hladinu globulinů. Jak bylo už řečeno při těžkých hepatopatiích nalézáme též velký pokles koncentrace albuminu. Zvýšená ztráta albuminu se objevuje u glomerulárních onemocněních (těžké glomerulonefritidy, amyloidosa, nefrotický syndrom jsou příčinou těžké alterace plasmatické hladiny albuminu. Středně těžké ztráty albuminu bývají při rozsáhlých kožních alteracích (popáleniny, omrzliny, traumata, pyodermie). Sekvestrace se objevuje v souvislosti se ztrátou onkotického tlaku, kdy dochází k formování podkožních edémů a efúzí v tělních dutinách čím se dále prohlubuje pokles plasmatické hladiny albuminu. Sekvestrace z jiných příčin jako je zvýšený hydrostatický tlak (portální hypertenze čí pravostranné srdeční selhání), zánětlivé procesy na tělních výstelkách ( např. a- či septická peritonitis) způsobují středně těžké ztráty albuminu. Imunitně zprostředkované nebo infekční vaskulopatie (endotoxemie/bakteriemie, ehrlichiosa, horečka Skalistých hor) působí středně těžké ztráty albuminu z vaskulárního kompartmentu.

Hyperalbuminemie ukazuje na stavy spojené s dehydratací, hlavně ve spojení se zvýšenou koncentrací celkové bílkoviny. Samozřejmě se může jednat o možnou laboratorní chybu viz. falešné zvýšení koncentrace při hyperlipemiích, hyperbilirubinémiích atd.. Při elektroforéze plasmatických lidských bílkovin je znám výskyt různě rychle putujících albuminu na nosiči , jedná se pravděpodobně jen o různé genetické varianty jež nemají klinický význam. U novorozenců se nalézá tzv. fetální albumin, jež je postupně během prvních měsíců nahrazen normálním albuminem. Tyto odchylky se dají předpokládat i u jiných živočišných druhů.

Globuliny

Jak už bylo řečeno elektroforéza rozděluje globuliny do tří frakcí alfa, beta, gama. Imunoglobuliny a komplement migrují hlavně v pásmu beta, gama. Ve frakci alfa migrují hlavně reaktanty časné fáze zánětu. Mnoho proteinů z oblasti alfa a beta je syntetizováno či uskladněno v játrech, což představuje asi 75-90% alfa globulinu a 50% beta globulinu. Reaktanty akutní fáze zánětu představují funkčně rozdílné proteiny plasmy normálně se vyskytujících ve velmi malých množstvích. Syntéza těchto proteinů se velmi rychle zvyšuje při poškození tkání (zánětlivém onemocnění) jako reakce na stimulaci cytokiny IL1, IL6, TNF-á. Při těchto stavech syntéza proteinů akutní fáze v játrech je upřednostněna a tudíž dojde k poklesu syntézy albuminu.

V alfa1 migrují lipoprotein A, alfa1 antitripsin, alfa1 glykoprotein. Lipoprotein A patří ke třídě HDL (High Density Lipoprotein), zvýšená hladina se popisuje v humánní medicíně u lidí s arteriosklerosou, naopak snížení u geneticky podmíněných deficiencích, výškové nemoci a u jaterních syndromů. alfa 1 antitrypsin je významný tělesný proteinásový inhibitor, jeho zvýšená koncentrace se vyskytuje u zánětlivých a neoplastických onemocněních. alfa 1 glykoprotein (známý též jako orosomukoid) je protein o poměrně nízké molekulové hmotnosti s vysokým procentem sacharidů (kolem 40%), k zvýšení dochází u chronických zánětů, novotvarů a reumatoidní artritidy. Během embryonálního vývoje je syntetizován v placentě a játrech á fetoprotein, též migrující v alfa 1 frakci. Zvýšená hladina se vyskytuje u různých neoplastických onemocněních jater (hepatocelulární karcinom) nebo placenty (gonadální karcinom) a při různých jaterních chorobách (virová hepatitis, chronická aktivní hepatitis a cirhóza). U psů zvýšení může být považováno za paraneoplastický marker různých jaterních neoplasií: hepatocelulární karcinom, cholangiosarkom, hepatální lymfosarkom atd.

Někdy se v oblasti mezi alfa 1, alfa 2 vyskytuje nárůst další frakce tzv. inter-alfa-proteiny. Mezi tyto bílkoviny patří řada látek vázajících hormony (globulin vázající thyroxin), transkortin a Gc globulin (skupinově specifické komponenty). Snížená hladina Gc globulinu se vyskytuje u těžkých jaterních onemocněních.

Alfa 2 globuliny obsahují velké množství složek z nichž nejvýznamnější jsou haptoglobin, ceruloplasmin, alfa 2 makroglobulin a alfa 2 glykoprotein. Haptoglobin váže uvolněný hemoglobin z erytrocytů, komplex haptoglobin-hemoglobin vykazuje navíc peroxidázovou aktivitu. Zvýšené hladiny se nacházejí při zánětlivých onemocněních, naopak snížené při těžkých hepatopatiích, hemolytické anémii a vrozené hypohaptoglobinémii. Ceruloplasmin je nejdůležitější protein vázající měď, chová se jako oxidáza. Zvýšení koncentrace nalézáme v těhotenství a při některých neoplasiích. alfa 2 makroglobulin působí jako proteinásový inhibitor, zvláště jako inhibitor plasminu a trombinu, zvýšená koncentrace se objevuje při nefrózách, hepatickém syndromu a při diabetu.

Beta frakce elektroforetického rozdělení bílkovin obsahuje řadu látek komplementového systému. Při těžkých autoimunitních reakcích dochází k poklesu hladin C1r, C3, C4 putujících v beta 1 regionu (např.SLE). Hlavními složkami jsou Lipoprotein B, Hemopexin, transferin. Lipoprotein B patří mezi liporoteiny LDL a VLDL (Low Density Lipoprotein, Very Low Density Lipoprotein), nárůst hladin se nalézá u nefrotického syndromu, dále u lidské arteriosklerózy, myxedému a jaterních chorob, snížení bylo v humánní medicíně popsáno u hypertyreózy jater a plasmocytomu. Hemopexin váže volný Hem uvolněný z hemoglobinu, což se děje hlavně při hemolytických anémíích, kdy dochází následně k snížení hladiny v séru. Humánní medicína uvádí zvýšené hladiny u chronických plicních onemocněních a snížené hladiny u jaterních poruch.

Transferin (siderofilin) slouží jako transportní nosič železa, vyskytuje se poměrně ve velkém množství a tvoří podstatnou část beta frakce. Zvýšené hladiny se popisují při léčbě estrogeny, v období gravidity a při nedostatku železa. Nižší koncentrace u cirhotických jaterních chorob, nefrózách a neoplasiích.

Při elektroforéze plasmy se v oblasti beta vyskytuje i  fibrinogen, základní složka koagulačního systému a také proteinů akutní fáze. Fibrinogen je syntetizován v játrech. Nízké hladiny fibrinogenu jsou výsledkem nízké produkce nebo zvýšené konsumpce. Odlišení snížené produkce od zvýšené utilizace může být velmi obtížné uvědomíme-li si, že při těžkých hepatopatiích dochází i ke stavům DIC. Zvýšené hladiny fibrinogenu se vyskytují při akutních zánětech a neoplaziích.

Při velkém zobecnění můžeme říci, že snížení alfa, beta a albuminové frakce doprovází těžké hepatopatie. Převážně v alfa 2 frakci migrují reaktanty časné fáze zánětu, proto zvýšení pozorujeme u zánětlivých onemocněních (příp. neoplaziích).

Gama globulinová frakce zahrnuje širokou škálu imunoglobulinů Ig A, Ig D, Ig E, Ig G, Ig M (dimer Ig A a Ig G mohou též migrovat v beta frakci).

Často se však elektroforegram infekční monoklonální gamopatie odlišuje od neoplastické zvýšením narůstajícího z široce založeného globulinového peaku, naopak u neoplasií může být nonparaprateinová frakce normální nebo snížená.

Plasmocytomy produkují často defektní protilátky, jenž obsahují pouze jeden typ řetězce (lamda nebo kapa) v L řetězci, zatímco normální typy imunuglobulinů mají oba typy řetězců. V lidské sféře se uvádí asi tato četnost imunoglobulinů v paraproteinové frakci myelomů 60% je typu Ig G, 15% Ig A a Ig M a asi v 10% dochází k zmnožení pouze L řetězců, velmi dobře pronikajících do moči tzv. Bence-Jonesova bílkovina. Elektroforegram při zvýšení pouze Bence-Jonesova proteinu nemusí vůbec vykazovat abnormality, samozřejmě existuje celá řada jiných znaků vedoucích k diagnóze.

Pro potvrzení diagnózy multipního myelomu musí být nalezeny alespoň dva z následujících znaků: monoklonální peak v beta či gama oblasti elektroforegramu, proteinurie (Bence-Jonesův protein), lytické kostní léze, plasmocytóza kostní dřeně.

K diagnostice paraproteinů lze též využít kryoprecipitaci, tato metoda je založena na reverzibilní precipitaci nebo formování gelu monoklonálních protilátek či imunokomplexů. Sérum s přítomností tzv. kryoglobulinů při nízké teplotě přejde z tekutého stavu v gelovou hmotu nebo se vysráží precipitát, při tělesné teplotě však opět ztekutí.

Kryoglobuliny byly u psů popsány u onemocnění multipním myelomem a makroglobulinémií.

Ve vzácných případech se lze s monoklonální gamopatií setkat též u onemocnění koček FIP.

Při nálezu polyklonální gamopatie a těžké svědivé dermatitidy je nutné nejdříve vyloučit přítomnost kožních parazitů (roztoči, blechy, velká invaze klíšťat). V diagnostice je nutné odběr vzorků několikrát opakovat, kvůli vyloučení falešně negativních výsledků přítomnosti roztočů, protože až opakovaným odběrem někdy docílíme nálezu zákožek (Sarcoptes scabiei), což většina praktiků může určitě potvrdit. Na diagnostiku srdeční červivosti bylo vyvinuto hodně diagnostických metod, jelikož však se jedná o pouze geograficky omezený problém především Severní Ameriky nebudou zde zmiňovány. V endemických oblastech Ehrlichiosy nebo horečky Skalistých hor se relativně často setkáme s příznaky anémie, trombocytopénie a leukocytopénie provázené hyperglobulinémií. V těchto případech je nutné stanovit titr protilátek proti ehrlichiím (ELISA, NFR) pro potvrzení diagnózy. Toto onemocnění se vyskytuje především v oblastech tropických a subtropických, ale v České republice ehrlichióza psů byla též prokázána. Dalšími infekčními chorobami s typickým výskytem polyklonální gamopatie u psů jsou brucelóza, blastomykóza, histoplasmóza, kokcidiomykóza a u koček též kryptokokóza. Samozřejmě všechny infekční nemoci chronického charakteru mohou vykazovat polyklonální gamopatii. Autoimunitní procesy a neoplasie se méně často projevují výraznou polyklonální hyperglobulinémií. Hyperglobulinémie spojená s hemolytickou anémií se vyskytuje u autoimunitní hemolytické anémie (AIHA). V těchto případech je doporučeno provézt Coombsův test a ANA test (VÚVeL Brno). Při kulhání a bolestivosti kloubů spojené s hyperglobulinémií je zase nutné stanovit revmatoidní faktor, ANA test a titr ricketsiálních protilátek.

Závěrem lze zjednodušeně konstatovat, že polyklonální gamopatie se vyskytuje u chronických infekčních chorob, alergií, autoimunitních procesů a neoplazií (následek exogenní a endogenní stimulace antigeny infekčního či neinfekčního původu).

Hypoglobulinémie se fyziologicky vyskytuje u novorozenců (celkový protein dosahuje pouze 60-80% hladiny dospělců). Vrozené a selektivní imunodeficience existují, ale zřídka bývají diagnostikovány pro časný úhyn stěňat na různé infekce. O imunodeficienci lze suspektně hovořit, jestliže více než jedno štěně z vrhu zahyne v období prvních 2-6 měsíců života na infekční onemocnění. U těchto zvířat lze elektroforézu a imunoelektroforézu doplnit kvantitativními metodami pro zjištění typu Ig deficience (např. RID). Kvantifikovat se musí všechny třídy imunoglobulinů a též subtypy Ig G. Nejčastěji se lze setkat se snížením koncentrace Ig G a Ig A a normální nebo sníženou Ig M. Též se u psů vyskytuje selektivní Ig A deficience a transientní hypogamaglobulinémie. Psi postižení selektivní Ig A deficiencí vykazují časté katary sliznic, zvláště bývá postiženo tenké střevo častým bakteriálním přerůstáním. Elektroforegram nemusí v beta a gama oblasti vykazovat snížení frakce, dokonce se nalézají hodnoty zvýšené (polyklonální elevace). Imunoelektroforézou lze dokázat sníženou až nulovou hladinu Ig A, ale tento nález bývá častý i u zdravých psů pro relativně malou koncentraci sérových Ig A nebo relativně častou laboratorní chybu. Metodou volby při selektivní Ig A deficienci je RID či raketová elektroforéza. IgA někdy může být spojena s elevací hladiny Ig M. U některých chronických enteropatií (lymfocytoplasmacytární enteropatie) může být hladina Ig A též snížena , ale může být i normální, jelikož sérová hladina ne vždy odráží lokální sekretorní Ig A deficience. Také nejsou důkladně prostudovány hladiny Ig A u jednotlivých plemen, proto interpretace hodnot může být zavádějící při posuzování chronických enteropatií.

Nejčastějšími příčinami získané hypogamaglobulinémie jsou ztráty většího množství krve a exudativní enteropatie, mezi méně časté příčiny patří hepatální insuficience a nefropatie spojená se ztrátou proteinu. Také u pacientů s paraproteinémiíje relativně častý výskyt snížené hladiny ostatních imunoglobulinů.

Výše uvedený hrubý výčet patologických odchylek elektroforetického rozdělení krevních bílkovin by měl ukázat výhody této metody v přiblížení diagnózy. Chápu, že v ČR není ještě mnoho veterinárních pracovišť s kvalitním přístrojovým a personálním zázemím pro výrobu a hodnocení elektroforegramů, ale dá se předpokládat že vrůstající zájem a tlak veterinárních lékařů tento stav napraví.

Rád bych též upozornil na nemalé možnosti při využití refraktometru v diagnostice hyperproteinémie a sedimentace erytrocytů přímo na klinickém pracovišti. Hyperglobulinémie a /nebo hyperfibrinogenémie při chronických zánětlivých stavech navozují zrychlení sedimentace erytrocytů. Zrychlená sedimentace erytrocytů spolu s hyper- či normoproteinémií může klinika navézt na podezření na abnormality v bílkoviném spektru v krevní plasmě.